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    ELISA實驗操作秘籍

    時間:2023-03-21 瀏覽次數:118


      如何利用ELISA篩選以及ELISA方法操作的注意事項有哪些呢?相信很多做實驗的小伙伴都有這樣的疑問,今天小編就給大家總結一下,注意聽講哦!

     

      ELISA,全稱酶聯免疫吸附實驗,主要利用的是抗原抗體特異性結合的特點,可分為直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法等。下面以間接法為例進行介紹:

     

      1、方陣ELISA。用途:①融合前后確定鼠血清中抗體效價;②拿到單抗腹水后,需要建立ELISA方法時首先要確定包被原及抗體的優質工作濃度。

     

      經典的方陣ELISA:將抗原和抗體各自稀釋成不同梯度濃度,結果ODP/N>2的均判為陽性,選取OD值在1.0左右的那個Ag-Ab濃度為工作濃度,其主要原因與酶標儀靈敏度有關。

     

      但是,對于抗原抗體而言,由于它們被稀釋成不同濃度,那么在理論上,每個抗原稀釋度情況下,總有一個抗體的稀釋度其OD值在1.0左右,那么到底選取哪一個OD1.0左右的好呢?這就需要同時用藥物做個抑制來看,哪個濃度下抑制情況好,就取哪個抗原抗體濃度做工作濃度。

     

      2、間接競爭ELISA:在用方陣ELISA確定好抗原抗體醉佳結合濃度后就可以做間接競爭ELISA了,其目的主要是考察抗體的特異性、繪制標準曲線,計算抗體對抗原的半數抑制、檢測限等參數,也可以用來檢測未知樣品中的抗體。方法是用確定的抗原包被,在加一抗時同時加入不同濃度的標準品(一般是藥物),然后加二抗,顯色。用藥物(即標準品)濃度的對數為橫坐標、抑制率為縱坐標,繪制ELISA標準曲線,計算相關的參數,之后就可以將未知的樣品所測OD值代入曲線方程求其中抗體的含量。通常這是建立ELISA檢測方法的bi備項目。

     

      標準曲線可以繪成直線或是曲線(二次方程或三次方程)。通常是選取線性比較好的幾個點繪成直線。直線斜率越高說明抗體的特異性及靈敏性好,R2

     

      值越靠近1,則說明線性關系好。曲線繪好后,有一些常用的參數,如抑制率、半數抑制、檢測限、定量限、標準偏差、變異系數等等:

     

      抑制率(%)=1B/B0B0為不含藥物的OD值;B為含有藥物的OD值)

     

      標準差(SD)=[(XiB ) 2 / (n1)] 1/2;

     

      標準偏差(RSD)=SD/B

     

      半數抑制:指用藥物(半抗原)去做競爭實驗時呈現50%抑制效果時的藥物濃度。藥物濃度越低,而抑制率越高,則表示抗體對藥物的特異性越好,靈敏度也高。半數抑制濃度IC50對應的OD值:OD IC500.5?B0

     

      檢測下限(LOD)對應的OD值:ODLOD =B03SD;

     

      定量限(LOQ)對應的OD值:ODLOQ = B010SD;

     

      3、間接ELISA操作中具體注意的問題:

     

      間接ELISA一般有6個步驟:包被抗原、封閉、加一抗(在做競爭時同時加入藥物)、加二抗、顯色、終止。其中除了加顯色和終止外,其余步驟之間都要進行洗板。在這里面,每一步都非常重要,假如有一步疏忽都會造成結果的不準確。


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